Całkowity RNA wyizolowano i transkrybowano do komplementarnego DNA (cDNA). Obliczenie ilościowe reakcji łańcuchowej reakcji łańcuchowej polimerazy SYBR na łańcuchy polimerowe w czasie rzeczywistym przeprowadzono z użyciem standardowych krzywych. Badania przesiewowe pod kątem mutacji Q295X z zastosowaniem trawienia enzymami restrykcyjnymi przeprowadzono u heterozygotycznych i homozygotycznych zdrowych członków rodziny, jak również u zdrowych osób z grupy kontrolnej. Fenotypowanie komórek T, regulacyjne barwienie komórek T i detekcja komórek Th17 (pomocnicze limfocyty T wytwarzające interleukinę-17) przeprowadzono zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami.32-36 Ekstrakty komórek jednojądrzastych krwi obwodowej od pacjentów z niedoborem białko CARD9 wybarwiono poliklonalnym kozim przeciwciałem anty-CARD9. (Szczegóły tych procedur są dostępne w dodatkowym dodatku.)
Retrowirusowe transdukcje ludzkich wariantów CARD9
CDNA CARD9 wytworzono z ludzkich jednojądrzastych komórek krwi obwodowej i klonowano do retrowirusowego wektora ekspresyjnego (opartego na mysim wirusie z komórek macierzystych) eksprymującym zielone białko fluorescencyjne.37. Mutację Q295X wprowadzono przy użyciu ukierunkowanej mutagenezy. Retrowirusy wytworzono przez transfekcję ekotropowo-pakującej linii komórkowej Phoenix i użyto do infekowania komórek szpiku kostnego, jak opisano wcześniej.37 Komórki szpiku kostnego różnicowano na makrofagi i stymulowano albo z użyciem curdlanu, selektywnego agonisty dektyny-1, albo lipopolisacharydu ultraczystego. Stężenia czynnika martwicy nowotworu . (TNF-.) w supernatantach analizowano za pomocą testu immunoenzymatycznego 22.23.38
Wyniki
Historia medyczna pacjentów
Rysunek 1. Rycina 1. Rodowód rodziny irańskiej z przewlekłą grzybicą śluzówkowo-skórną. W panelu A okręgi oznaczają żeńskie rodziny; kwadraty męscy członkowie rodziny; pacjentów z pełnymi kółkami i kwadratami z przewlekłą kandydozą śluzówkowo-skórną, którzy byli homozygotyczni pod względem mutacji Q295X; półpełne koła i kwadraty członków, którzy byli heterozygotyczni pod względem mutacji Q295X; otwarte kręgi i kwadraty zdrowych członków z CARD9 typu dzikiego i podwójne linie poziome współzależności u małżeństwa. Cięcie oznacza zmarłego członka rodziny. Gwiazdki wskazują członków rodziny, których próbki zostały zsekwencjonowane. W panelu B sekwencja na górze jest dla zdrowego członka rodziny z CARD9 typu dzikiego. Środkowa sekwencja, uzyskana od Pacjenta 1M, jest charakterystyczna dla osoby z homozygotyczną mutacją CARD9, w której wymiana pojedynczej nukleotydy (C . T) w eksonie 6 z CARD9 powoduje przedwczesny kodon stop (Q295X). Dolna sekwencja od Pacjenta 1G1 jest charakterystyczna dla zdrowej osoby heterozygotycznej.
Rodowód (ryc. 1A) dla pokrewnej rodziny irańskiej pokazuje, że przewlekła kandydoza śluzówkowo-skórna była dotknięta wieloma członkami przez przypuszczalnie autosomalny recesywny tryb dziedziczenia. Nawracające infekcje grzybicze zdiagnozowano klinicznie u ośmiu członków rodziny, z których troje zmarło we wczesnym okresie dojrzewania – dwóch z udowodnionymi i jeden z domniemaną inwazyjną infekcją Candida mózgu. Żaden z ośmiu zainfekowanych pacjentów nie miał niezwykłych infekcji bakteryjnych lub wirusowych, co sugeruje, że obrona gospodarza przed tymi patogenami była normalna.
Pacjentem wskaźnikowym (pacjent 2B2) był 19-letni mężczyzna, który miał jamy ustnej kandydozy (pleśniawki) od 3 roku życia
[przypisy: lekarstwo z orzecha włoskiego, diastazy w moczu, kwas paraaminobenzoesowy ]
Powiązane tematy z artykułem: diastazy w moczu kwas paraaminobenzoesowy lekarstwo z orzecha włoskiego