Dane kliniczne i laboratoryjne przedstawiono w Tabeli 1. Sekwencjonowanie DNA i pomiar leptyny
Sekwencjonowanie LEP przeprowadzono na genomowym DNA przy użyciu standardowych protokołów. Kontrole genotypowania objęły 720 dzieci w wieku szkolnym z Ulm w Niemczech (146 z nich pochodziło z Turcji). Stężenie leptyny w surowicy i pożywce do hodowli komórkowej mierzono za pomocą enzymatycznych testów immunoabsorpcyjnych. Pisemną świadomą zgodę uzyskano od rodziców pacjenta i kontroli. Badanie zostało zatwierdzone przez komisję etyczną Uniwersytetu w Ulm. Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat metod badania, patrz Dodatek dodatkowy.
Badania klonów i sekrecji
Nie zmutowana i zmutowana (D100Y) leptyna była przejściowo eksprymowana w ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych 293 (HEK293). Pożywkę hodowlaną i lizaty komórkowe poddano analizie Western blot z poliklonalnym przeciwciałem leptyny (Biovendor). Nie zmutowane leptyny-mCherry i zmutowane fluorescencyjne białka fuzyjne D100Y leptyna-mCherry wytworzono w celu zbadania wiązania receptora leptyny i internalizacji.
Badania funkcjonalne
Uzyskano komórki HEK293 wyrażające ludzki receptor leptyny (pMET7-hLR-FLAG). Szczegółowe informacje na temat działalności, wiążące, internalizacji i badań konkurencji znajdują się w Dodatku uzupełniającym.
Wytwarzanie i oczyszczanie rekombinowanych białek leptyny
Niemutujące i leptyna D100Y wytworzono w zakażonych bakulowirusem Trichoplusia ni komórkach BTI-Tn-5B1-4 (High Five Cell Line, Life Technologies). Białka oczyszczono z odpowiednich supernatantów komórkowych za pomocą chromatografii sekwencyjnej.
Badania na zwierzętach
8-tygodniowe samice myszy ob / ob otrzymywały codzienne iniekcje dootrzewnowe nośnika (sześć myszy), 0,2 .g nie zmutowanej leptyny na gram masy ciała (sześć myszy) lub 0,2 .g leptyny D100Y na gram (sześć myszy), dla 4 dni. Następnie dawkę zwiększono do 0,6 .g na gram przez 3 dni. Masę ciała i jedzenie przyjmowano codziennie. Dwukierunkową analizę wariancji z wielokrotnymi porównaniami skorygowanymi markerem Bonferroni przeprowadzono za pomocą oprogramowania GraphPad Prism, wersja 6.01 (www.graphpad.com). Eksperymenty zostały zatwierdzone przez władze lokalne.
Wyniki
Mutacja LEP
Stężenie leptyny w surowicy u naszego pacjenta okazało się wysokie (42,6 ng na mililitr) (Tabela 1). Na podstawie fenotypu klinicznego podejrzewaliśmy mutację w genie kodującym receptor leptyny (LEPR), który wykluczaliśmy przez sekwencjonowanie. Kolejne sekwencjonowanie LEP ujawniło nową homozygotyczną transwersję (c.298G . T) w eksonie 3, prowadząc do zmiany z kwasu asparaginowego na tyrozynę w pozycji 100 białka (p.D100Y) (ryc. S1 w dodatku uzupełniającym). Oboje rodzice byli heterozygotycznymi nosicielami mutacji (ryc. S1 w dodatkowym dodatku). Badanie przesiewowe 720 etnicznie podobnych dzieci w południowych Niemczech nie ujawniło żadnych nosicieli mutacji. Nie ma go w dbSNP, Human Gene Mutation Database, ClinVar lub Ensembl Genome Browser.
Wszystkie przypadki wrodzonego niedoboru leptyny do tej pory charakteryzowały się brakiem lub prawie brakiem krążącej leptyny (więcej informacji w Dodatku Uzupełniającym), 2,3,5-8, podczas gdy nasz pacjent miał wysoki poziom hormonu. Dlatego badaliśmy zachowanie sekrecyjne mutanta D100Y w heterologicznym układzie komórkowym. Plazmidy kodujące nie zmutowaną i zmutowaną leptynę przejściowo wprowadzano do komórek HEK293. Oba nie zmutowane i zmutowane białka występowały obficie w lizatach komórkowych i wykryto je także w środkach nadsączu nienaruszonych komórek (Figura 1C). To wyraźnie pokazuje, że nowa mutacja nie zakłóca ani ekspresji białka, ani wydzielania leptyny.
Ocena funkcjonalna zmutowanej leptyny
Figura 2. Figura 2. Bezczynność biologiczna zmutowanej leptyny D100Y in vitro i in vivo. Panel A pokazuje wyniki doświadczeń in vitro wykazujących brak fosforylacji Stat3 przez zmutowany D100Y leptynę. Komórki HEK293 przejściowo transfekowano pustym wektorem lub wektorem kodującym ludzki receptor leptyny (hLR). Komórki traktowano średnimi supernatantami z komórek HEK293, które transfekowano pustym wektorem (kontrola), wektorem kodującym nie zmutowaną leptynę lub D100Y leptynę. Stężenia niemyślnika i leptyny D100Y doprowadzono do 30 ng na mililitr. Po 15 minutach wytworzono lizaty białkowe i poddano analizie Western blot z przeciwciałami pStat3 i Stat3; .-tubulina służyła jako kontrola obciążenia. Przedstawiono wyniki jednego reprezentatywnego eksperymentu z trzech wykonanych. Panel B pokazuje wyniki eksperymentów wykazujących niezdolność leptyny D100Y do wiązania się z receptorem leptyny
[patrz też: kreatynina cena badania, kwas paraaminobenzoesowy, ile trwają studia ]
Comments are closed.
Powiązane tematy z artykułem: ile trwają studia kreatynina cena badania kwas paraaminobenzoesowy
Dużo błonnika, to wkrótce będzie awitaminoza
[..] Oznaczono ponizsze tresci z artykulu oryginalnego: schodołaz gąsienicowy[…]
Co jest w pakiecie takiego zabiegu
[..] Odniesienie w tekscie do grzybica paznokci[…]
Aby być zdrowym trzeba chcieć się wyleczyć!
[..] Cytowany fragment: probolan[…]
Uprawiam delikatnie sport