Brak specyficznego zaburzenia immunologicznego doprowadził nas do zastosowania metody klonowania pozycyjnego w celu zidentyfikowania podstawowej wady genetycznej pacjenta. Analiza sprzężeń genetycznych
Analiza genotypów SNP wykazała region doskonałej segregacji na chromosomie 9 (od 137,5 do 138,8 Mbp w strukturze genomu ludzkiego 36), pod warunkiem, że epizod infekcji Candida pacjenta 1B1 był wynikiem fenokopii. To odkrycie zostało potwierdzone przez genotypowanie czterech markerów mikrosatelitarnych, uzyskując szczyt punktacji wielotunowej wynoszący 3,6 (patrz Dodatek dodatkowy).
W maksymalnym przedziale łączącym zdefiniowanym przez markery mikrosatelitarne D9S2157 (135,0 Mbp) i D9S1838 (139,8 Mbp) istniało 121 genów. Spośród tych 121 genów 41 znajduje się w idealnie segregującym podprzedziale 1,3-Mbp sugerowanym przez dane SNP. Po zbadaniu literatury zidentyfikowaliśmy CARD9 – która znajduje się wśród 41 idealnie zlokalizowanych genów (patrz Tabela S2 w Dodatku Dodatkowym) – jako kandydat funkcjonalny, ponieważ myszy Card9 – / – są podatne na infekcje grzybicze (szczegółowe informacje znajdują się w Dodatku Uzupełniającym ) .2,39
Mutacje homozygotyczne w KARTACH9
Przeprowadziliśmy sekwencjonowanie CARD9 u czterech pacjentów dotkniętych chorobą i 18 innych krewnych i zidentyfikowaliśmy u wszystkich osób dotkniętych jedną homozygotyczną mutacją punktową od C do T w eksonie 6 w kodonie 295, powodując przedwczesny kodon terminacji (Q295X). Pacjent 1B1 i jego zdrowi krewni mieli mutację heterozygotyczną Q295X lub allele typu dzikiego (Figura 1B).
Aby ocenić częstotliwość tej nieznanej wcześniej nieprawidłowości genetycznej w CARD9 i wykluczyć możliwość zmiany genetycznej, zbadaliśmy miejsce dotknięte chorobą u 50 niespokrewnionych zdrowych Irańczyków i 180 niespokrewnionych zdrowych białych osobników za pomocą testu sekwencyjnego lub testu z enzymem restrykcyjnym . Żadna z 230 kontroli nie miała mutacji Q295X w CARD9.
Poziomy mRNA CARD9 i ekspresja białka
Wśród komórek CARD9 typu dzikiego średnie poziomy mRNA CARD9 były najwyższe w monocytach, a następnie w granulocytach, limfocytach B i T oraz w linii komórkowej okrężnicy HT-29. Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej od naszych pacjentów nadal miały znaczny poziom zmutowanego mRNA CARD9, tym samym unikając rozpadu RNA, w którym pośredniczy nonsens (patrz Dodatek dodatkowy).
Figura 2. Figura 2. Wykrywanie Western blot CARD9 w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej. Makrofagi z myszy dzikich Card9 Card9 (Card9 + / +) i myszy Knockout Card9 (Card9 – / -) zastosowano jako kontrole pozytywne i negatywne (ścieżki i 2), odpowiednio. Błot na ścieżce 4 pochodzi z Względnego 4F, który na ścieżce 5 z Względnego 2G2, i na ścieżce 6 z Pacjenta 2M. Dehydrogenaza aldehydu glicerynowego-3-fosforanu (GAPDH) została użyta jako kontrola obciążenia.
Aby zbadać wpływ mutacji CARD9 Q295X na poziomie białka, oceniliśmy ekspresję CARD9 w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej od pacjentów, stosując metodę Western blotting. W porównaniu z niespokrewnionymi zdrowymi kontrolami i homozygotycznymi lub heterozygotycznymi zdrowymi członkami rodziny, pacjenci z homozygotyczną mutacją Q295X całkowicie nie wykazywali ekspresji białka CARD9 typu dzikiego (Figura 2), co wskazuje na szkodliwe konsekwencje mutacji. Nie można jednak wykluczyć ekspresji obciętego białka CARD9 (aminokwasy od do 294), ponieważ użyte przeciwciało poliklonalne skierowane jest przeciwko C-końcowej części CARD9.
Wpływ CARD9 Q295X na transdukcję sygnału
Rysunek 3
[podobne: hi kwas, rzadkie choroby genetyczne spis, pelagra choroba ]
Powiązane tematy z artykułem: hi kwas pelagra choroba rzadkie choroby genetyczne spis