Homozygotyczna mutacja CARD9 w rodzinie ze skłonnością do zakażeń grzybiczych ad 6

3. Analiza defektu funkcjonalnego i genetycznego odtworzenia Card9 Q295X Mutacja. Makrofagi pochodzące od szpiku kostnego myszy typu dzikiego i myszy Card9 – / – stymulowano przez 16 godzin zarówno z agdorfinem dektyny-1 curdlan (300 .g na mililitr), jak i lipopolisacharydem agonisty receptora podobnego do opłat (LPS, 100 ng na mililitr) (panel A). Stężenie wydzielanego czynnika martwicy nowotworu (TNF-a) określono w supernatancie komórkowym za pomocą testu immunoabsorpcji enzymatycznej. Aby zbadać wpływ zmutowanego CARD9 Q295X na transdukcję sygnału (Panel B), sklonowaliśmy ludzki niekompletny DNA CARD9 (cDNA) i zmutowano cDNA CARD9 Q295X do retrowirusowego wektora ekspresyjnego. Używając tych konstruktów, retrowirusowo transdukowaliśmy pierwotne komórki szpiku kostnego myszy Card9 – / – albo CARD9 typu dzikiego albo zmutowanego CARD9 Q295X. Aby ustanowić kontrolę, transdukowaliśmy komórki szpiku kostnego od myszy Card9 + / + typu dzikiego i myszy Card9 – / – za pomocą wektora kontrolnego. Transdukowane komórki szpiku kostnego zostały następnie zróżnicowane do makrofagów in vitro. Po stymulacji makrofagów kurdanem przez 16 godzin określono stężenie wydzielanego TNF-.. Makrofagi myszy Card9 – / – transdukowanych ludzkim CARD9 typu dzikiego wydzielały tyle TNF-a po stymulacji kurdanem, jak kontrolne makrofagi myszy Card9 + / + dzikiego typu z wektorem kontrolnym. W przeciwieństwie do tych komórek, makrofagi myszy Card9 – / – transdukowanych zmutowanym ludzkim CARD9 Q295X lub z wektorem kontrolnym tylko nie reagowały ze zwiększoną sekrecją TNF-a po stymulacji kurdanem, co pokazuje, że CARD9 Q295X jest stratą Mutacja funkcji, która nie może skorygować szlaku sygnalizacji dectin-1 / Card9 w komórkach myszy Card9 – / -. T bary oznaczają standardowe odchylenia w trzech niezależnych eksperymentach. Pierwotne komórki szpiku kostnego myszy z niedoborem Card9 poddano retrowirusowej transdukcji ludzkim dzikim typem i zmutowanej (Q295X) CARD9, zróżnicowano do makrofagów in vitro i analizowano za pomocą cytometrii przepływowej (patrz Dodatek dodatkowy). Następnie stymulowaliśmy transdukowane lub nieprzetransdukowane komórki preparatem curdlan .-glukanu jako specyficznego i selektywnego agonistę dla dektyny-1 lub lipopolisacharydu liganda TLR4 i zmierzono wytwarzanie TNF-. w celu przetestowania wrodzonej aktywacji komórek immunologicznych.38 Jak jest zgodne z poprzednim dane, komórki Card9 – / – wykazały poważne defekty wytwarzania TNF-. wywołanego przez dektynę-1, chociaż reagowały one normalnie na stymulację lipopolisacharydem (Figura 3A) .22 Ekspresja ludzkiej pełnej długości CARD9 korygowała defekt sygnalizacyjny dektyny-1 w Komórki Card9 – / – wskazujące, że ludzkie białko może uzupełniać mutację mysią. Ekspresja ludzkiego mutanta CARD9 Q295X nie zwiększała wytwarzania TNF-., po stymulacji dektyną-1, powyżej poziomu w niezainfekowanych komórkach lub tylko transdukowanych białkiem z zieloną fluorescencją, pokazując, że CARD9 Q295X jest mutacją utraty funkcji ( Figura 3B).
Mutacje homozygotyczne Q295X i komórki Th17
Rysunek 4. Rysunek 4. Odsetek komórek CD4 + CD45RO + produkujących interleukinę-17 +, które negatywnie wpływały na produkcję interferonu-. u czterech pacjentów z mutacją homozygotyczną w karcie CARD9 w porównaniu z niespokrewnionymi zdrowymi kontrolami
[więcej w: siatki centylowe niemowląt, poradnia psychologiczna kielce, dyżury aptek kluczbork ]