Protokół badania został zatwierdzony przez komisję etyczną Nijmegen-Arnhem, Holandia. Pisemną świadomą zgodę uzyskano od wszystkich członków rodziny badanych. Ponadto zbadaliśmy próbki DNA, wcześniej zebrane w celu oceny częstości występowania mutacji Tyr238X, z kilku populacji w różnych lokalizacjach geograficznych. Próbki te otrzymano z kraju pochodzenia, z wyjątkiem chińskiej kohorty Han, dla której próbki pochodziły z Instytutu Corriella (numer katalogowy, HD1000CHI). W przypadku wszystkich populacji podmioty wyraziły pisemną, świadomą zgodę, a zatwierdzenie badania uzyskano od lokalnych komisji etycznych.
W analizach haplotypów wykorzystano dane na temat genomewidu na polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (SNP) z 1422 białek z kohorty urodzenia z 1958 roku w Wielkiej Brytanii13 iz 171 Masajów z Kinyawa, Kenia14. Dane genotypowe dla populacji Masajów pobrano z International HapMap Project Web stronę (www.hapmap.org) i dla białej populacji uzyskano za pomocą HumanHap300 BeadChips (Illumina). Region o wielkości 20 kb wokół SNP rs16910526 został wyodrębniony ze wszystkich próbek w obu zestawach danych SNP genomewidu. Użyliśmy programu komputerowego Beagle do określenia haplotypów z genotypów wszystkich przedmiotów
Analiza genetyczna
Szczegółowy opis metod stosowanych do sekwencjonowania genu dektyny-1 przedstawiono w Dodatku Dodatkowym (dostępnym wraz z pełnym tekstem tego artykułu na stronie). Analizę sieci przeprowadzono za pomocą programu Network, wersja 4.5.0.0 (www.fluxus-engineering.com), który wykorzystuje metodę mediany łączenia16. Starożytny haplotyp został określony za pomocą bazy danych dbSNP (www.ncbi.nlm .nih.gov / projects / SNP /). Przeprowadzono różne analizy, z uwzględnieniem ważenia oddzielnie dla zmian synonimicznych, niesynonimowych zmian, przejść i przekrojów.
Modelowanie struktury Dectin-1
Struktura krystaliczna mysiej dektyny (Kod banku danych 2cl8) została wykorzystana jako wzorzec do zbudowania modelu homologii zewnątrzkomórkowej domeny ludzkiej dektyny-1. Modelowanie domeny zewnątrzkomórkowej przeprowadzono na serwerze WHAT IF (http.//swift.cmbi.ru.nl). Dokonano minimalizacji zużycia energii i przeprowadzono analizę, aby uzyskać najbardziej wiarygodny model zwijania białek za pomocą programu YASARA (www.yasara.org/).17
Aktywowane fluorescencyjnie sortowanie komórek
Ludzkie jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) uzyskano od trzech członków rodziny, którzy byli homozygotyczni pod względem mutacji dectin-1, dwóch członków rodziny, którzy byli heterozygotyczni pod względem mutacji dectin-1, oraz pięciu osób, które były homozygotami pod względem typ allelu dectin-1. Komórki inkubowano z mysim przeciwciałem monoklonalnym anty-dektyny-1 GE2 (5 .g na mililitr) 18 lub przeciwciałem kontrolnym izotypem, a następnie sprzężonym z allofikocyjaniną przeciwciałem z kozim antymubiem (Pharmingen). Ekspresję dektyny-1 określono za pomocą cytometrii przepływowej z użyciem sortera komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACSCalibur, BD Biosciences). Ekspresję dektyny-1 oceniano w komórkach mysiej zarodkowej linii komórek fibroblastów (NIH3T3) po transfekcji, z użyciem przeciwciała antyhemaglutyniny (Covance), przeciwciała kontrolnego izotypowego IgG1 i przeciwciała anty-kowalencyjnego kowalencyjnie znakowanego R-fikoerytryną ( Jackson ImmunoResearch).
Wiązanie Candida, fagocytoza i testy zabijania grzybów
Wiązanie PBMC do C
[podobne: kreatynina cena badania mazowieckie, ile trwają studia, kreatynina cena badania ]
Powiązane tematy z artykułem: ile trwają studia kreatynina cena badania rzadkie choroby genetyczne spis