Testy fagocytozy i zabijania grzybów dla C. albicans przeprowadzono jak opisano wcześniej. Pomiary cytokin
PBMC12 (5 x 105) inkubowano ze 100 .l .-glukanu (10 .g na mililitr) i C. albicans, który był żywy lub został zabity w wysokiej temperaturze (przez ogrzewanie przez 30 minut w 56 ° C) w stężeniu × 106 komórek drożdży na mililitr. W przypadku testów stymulacji interleukiny 17 PBMC stymulowano przez 5 dni w pożywce RPMI uzupełnionej 10% połączoną surowicą ludzką. Po 4 godzinach, 24 godzinach lub 5 dniach inkubacji w 37 ° C, supernatanty zebrano i przechowywano w -70 ° C aż do testu immunoenzymatycznego z zestawem odczynników PeliKine-Tool (Sanquin).
Badania klonów i transfekcji
Ludzkie izoformy dektyny-1 amplifikowano za pomocą testu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), z komplementarnego DNA wyizolowanego z próbek leukocytów krwi obwodowej otrzymanych od pacjentów. Dwa zastosowane startery to 5 -AAAGGATCCAGGGGCTCTCAAGAACAATG-3 i 5 -AAACTCGAGTCTTCCACCCTTCCCCTTAC-3 . Produkty PCR oczyszczono przy użyciu zestawu QIAquick PCR purification kit (Qiagen), wklonowano do wektora pCR4-TOPO3.1 (Invitrogen) i zsekwencjonowano. Dektynę-1 typu dzikiego i zmutowaną klonowano stosując startery odwrotne – odpowiednio 5 -CCCTTCCTCGAGCATTGAAAACTTC-3 i 5 -AAATCTCGAGTGAGGGCAGACTAC-3 , pozwalające na klonowanie w ramce znacznika hemaglutyniny, co nie wpływają na wiązanie .-glukanu. 7 Produkty subklonowano do retrowirusowego wektora pFB-Neo (Stratagene) i transfekowano do ekotropowych komórek pakujących (Phoenix) przy użyciu odczynnika do transfekcji FuGENE (Roche Molecular Biochemicals). Po 48 godzinach zebrano supernatanty retrowirusowe i zastosowano do transdukcji komórek NIH3T3 w obecności Polybrene (Sigma), w stężeniu 5 .g na mililitr. Przeprowadzono również test wiązania dla zymosanu, jak opisano wcześniej
Wyniki
Pacjenci i rodowód
Podczas pierwszej fazy badania zidentyfikowaliśmy pacjenta (pacjenta wskaźnikowego), który miał nawrotową kandydozę sromowo-pochwową i miał komórki, które wykazywały niską reakcję na stymulację C. albicans, zdefiniowaną jako produkcja cytokin, która wynosiła 15% lub mniej stymulowanej przez C. albicans w komórkach od zdrowych ochotników. Brak produkcji cytokin został określony jako zaburzona odpowiedź na .-glukan, co wskazuje na potencjalną wadę rozpoznawania dektyny-1.
Ryc. 1. Ryc. 1. Mutacja Dectin-1 w rodzinie z śluzówkowo-skórnymi infekcjami grzybiczymi. Panel A pokazuje strukturę genu dektyny-1 i lokalizację mutacji kodonu wczesnego stopu składającego się z homozygotycznego polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (rs16910526, ekson 6, chromosom 12, lokalizacja, 10162354 bp). Mutacja (A . C) powoduje zmianę aminokwasu 238 z tyrozyny na kodon stop (Tyr238X), co prowadzi do utraty ostatnich dziewięciu aminokwasów domeny rozpoznawania węglowodanów (CRD). Cyto oznacza ogon cytoplazmatyczny, a TM region transbłonowy. Panel B pokazuje genetyczny rodowód rodziny wskaźników z niedoborem dektyny-1. Koła wskazują pacjentki; kwadrat wskazuje ojca
[patrz też: ślepa próba, specjalizacje lekarskie wykaz, poradnia psychologiczna kielce ]
Powiązane tematy z artykułem: poradnia psychologiczna kielce ślepa próba specjalizacje lekarskie wykaz