Warianty zerowe TBX6 i wspólny allomię hipomorficzną w skoliozy wrodzonej AD 4

W podgrupie z wrodzoną skoliozą stwierdziliśmy, że 5 z 6 osób (83%) miało hemizygotyczny haplotyp TCA (tabela 2). Jedyny wyjątek (Patient PT03) miał afrykańskie pochodzenie13, a haplotyp TCA jest rzadkością wśród takich osób (rozpowszechnienie, <1% wśród Afrykanów, w porównaniu z 44% wśród Azjatów i 33% wśród osób pochodzenia europejskiego) (Tabela Pacjent PT03 miał allel nierepresyjny SNP rs111939223 (obecny u 4% Afrykanów Joruba, ale nieobecny u Azjatów i Europejczyków), który znajduje się w przewidywanym miejscu poliadenylacji informacyjnego RNA TBX6.28. Dlatego nie można wykluczyć możliwości dziedziczenia związku mutacja zerowa TBX6 i alternatywny haplotyp ryzyka wśród osób pochodzenia afrykańskiego u pacjenta PT03. W podgrupie bez skoliozy haplotyp TCA był obecny tylko u 5 z 30 osób (17%) (tabela S7 w dodatkowym dodatku). Haplotyp ryzyka TCA był istotnym czynnikiem ryzyka skoliozy wrodzonej w serii 3 (5 z 6 osób z wrodzoną skoliozą vs. 5 z 30 osób bez skoliozy, P = 0,004 według dokładnego testu Fishera), co dodatkowo wspiera model dziedziczenia związku TBX6 zaburzenie.
Haplotype ryzyka hipomorficznego In Vitro
SNPs TBX6 określające haplotyp dla ryzyka skoliozy wrodzonej mogą być funkcjonalne lub, alternatywnie, mogą być złożonym markerem genetycznym związanym z prawdziwymi wariantami funkcjonalnymi. Przeprowadziliśmy analizę sprzężeń i nierównowagi przy użyciu zwykłych ludzkich SNP22 i odkryliśmy, że blok sprzężenia i nierównowagi TBX6 jest krótki (5 kb na podstawie reguły czterech gam) (ryc. S4 w dodatku uzupełniającym). W tym bloku nie stwierdziliśmy żadnej rzadkiej mutacji. Najbardziej oszczędnym wyjaśnieniem tej obserwacji jest to, że wspólne SNPs TBX6 określające haplotyp ryzyka są funkcjonalne.
SNPs rs3809624 i rs3809627 znajdują się w niekodującym regionie 5 TBX6 (Figura 1B), potencjalnie regulując ekspresję TBX6. 29 Dane z Encyklopedii Elementów DNA (ENCODE) Projekt sugerują możliwy udział tych dwóch niekodujących SNP w regulacji ekspresja genów.30 Na przykład, oba SNP znajdują się w tym samym miejscu wiązania pierwszego czynnika stymulującego (USF1), czynnika transkrypcyjnego potencjalnie zaangażowanego w somitogenezę.31,32
Rycina 3. Rycina 3. Wyniki funkcjonalnych testów In Vitro wspólnych wariantów TBX6 i mechanistycznego modelu skoliozy wrodzonej związanej z TBX6. Panel A pokazuje wyniki testów reporterowych lucyferazy. Zastosowano dwa typy komórek (komórki P19CL6 i indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki macierzyste [hiPSC]) o wysokim poziomie ekspresji TBX6 podczas indukowanego różnicowania. Bezresortowe allele rs3809624 i rs3809627 są zaznaczone na niebiesko, a haplotyp ryzyka jest podkreślony. Wyznaczono ilościowo co najmniej trzy niezależne doświadczenia znormalizowanej aktywności lucyferazy, z wykresem pokazującym wartości średnie i ich błędy standardowe (pręty I). Panel B przedstawia uproszczony model genetyczny skoliozy wrodzonej związanej z TBX6. Ekspresja TBX6 ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego tworzenia kręgów (allel referencyjny TBX6 jest oznaczony przez czarną linię). Heterozygotyczne warianty hipomorficzne (pokazane na niebiesko) powodują tylko umiarkowaną redukcję ekspresji TBX6. Nawet homozygotyczne hipomorficzne warianty nie radykalnie zmniejszają ekspresję TBX6. Heterozygotyczne mutacje null TBX6 (oznaczone czerwonymi nawiasami) mogą zmniejszać ekspresję genów o połowę. Niezależnie od tego, mutacje te prawie nie osiągają progu dawkowania genów w przypadku skoliozy wrodzonej. W połączeniu jednak allel zerowy i hypomorficzny allel TBX6 powodują dalsze zmniejszenie ekspresji genów, co może powodować wysokie ryzyko skoliozy wrodzonej.
Zastosowaliśmy testy lucyferazy in vitro w celu zbadania wpływu rs3809624 i rs3809627 na ekspresję genów. Wstępne analizy w trzech ludzkich liniach komórkowych (HEK293, HepG2 i HeLa) wykazały znaczące obniżenie ekspresji genu reporterowego po połączeniu z częścią TBX6 zawierającą warianty niereferencyjne zarówno w rs3809624, jak i rs3809627 (Fig. S5 i S6 w dodatkowym dodatku ). Przeprowadziliśmy ten sam eksperyment z użyciem multipotencjalnych komórek P19CL616,17 i hiPSC. TBX6 ulegał silnej ekspresji w tych komórkach macierzystych, gdy różnicowały się w linie komórek mezodermalnych (ryc. S5 w dodatku uzupełniającym). Zaobserwowaliśmy, że komórki P19CL6 i hiPSC niosące konstrukt reportera lucyferazy z allelami nieinferencyjnymi zarówno w rs3809624, jak i rs3809627 eksprymowały znacząco mniej białka reporterowego na różnicowanie się komórek mezodermalnych i sercowych (Figura 3A). Odkrycia te konsekwentnie potwierdzają hipomorficzne efekty kombinacji alleli niereferencyjnych w rs3809624 i rs3809627 na ekspresję TBX6.
Hemodyktra u osób ze współistniejącą towarzyszącą TBX6 skoliozą
Aby ocenić wpływ rozerwania TBX6 na cechy morfologiczne wad rozwojowych kręgów, ocenialiśmy typy wad kręgosłupa u 23 osób z sporadycznym zespołem
[podobne: ślepa próba, ile trwają studia, kreatynina cena badania ]